microRNA实验方法

将胶浸泡在0.5ⅹTBE大约 10min 。

用EtBr （0.5ug/ml）染胶10min 后，用紫外凝胶观测RNA电泳情况（参考Ambion公司的条带分析）。用0.5ⅹTBE 洗胶 5min.

用铅笔标记好转膜的面，将 Nylon membrane（GE公司）和两片厚滤纸浸泡在 0.5ⅹTBE 大约10min.

制备凝胶、膜夹层。将滤纸、胶、膜、滤纸形成三明治结构，注意胶应该靠近阴极侧。注意每层间不能有气泡。

装配好转膜装置，装置同Western Blotting转膜装置。

于冰上300mA转膜 1 h。

把膜（RNA 面朝上）放在紫外交联仪中使用4000J UV进行交联.

将膜夹在厚的滤纸中间，80℃烘烤0.5-2 h，可以轻压，以防止膜发生翻卷。

如果可以直接做，则放在室温即可；也可以储存在4ºC ，直到使用（可储存6个月）。

亚甲蓝（methylene blue）染色 3~5min, 在可见光下 黄色滤光片对膜照相。

7.杂交

在杂交炉中37- 42℃ 在杂交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中预杂交1h , 然后将膜放入杂交袋，然后加入配好浓度的Dig-Labeled probe，在杂交炉中37- 42℃杂交过夜。Dig-Labeled probe使用浓度：将10ul的25uM的公司原液稀释十倍后分装储存，取储存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6内参）或2.7-27ul储存液/10ml杂交液（根据miRNA的量或丰度定）。

37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。

室温MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。

室温用Blocking Solution（用MAB 10倍稀释10×Blocking Solution）封闭 1h 。

室温加入anti-Dig antibody 40 min（1:10000-1:5000 in Blocking Solution）。注意：抗体用之前，应该以12000g速度离心5 min。

用MABT液洗膜两次，每次15 min。

膜在Detection buffer（ 0.1 M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5）中平衡5 min。

配CSPD液（1：100 Detection Buffer），有RNA的膜面向上放入杂交袋中，加入1ml 配好的CSPD液，挤出气泡，封口，孵育5 min。

挤出CSPD液，封口，37℃孵育5-15 min。

曝光2 min~1h（根据情况定）。一般内参U6在5分钟内即可显影。

实验注意事项

配胶时，由于浓度较大，所以尿素比较难溶，尿素的溶解不能加热，可以采用振荡或颠倒离心管；配好的无APS和TEMED的15%的Ura-PAGE胶可以储存在室温或4℃冰箱中（可储存1个月左右）。

电泳前，应该按照步骤将装置尽量进行RNAase free处理。

RNA上样前，300V 预电泳10min（防止胶漏，同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。此操作需要一定的训练，因为加样孔中很快会析出尿素，一旦有尿素析出对RNA电泳的形态会有一定的影响。

LNA探针使用前进行分装，然后冻存于-70℃冰箱中。

不同miRNA杂交的温度和时间不同，需要进行条件的摸索。一般内参温度为42℃。

尼龙膜紫外交联和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

三、miRNA靶基因的鉴定

由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性,利用生物学实验方法可以更加直观地寻找miRNA靶基因.目前主要是从mRNA水平与蛋白质水平来寻找靶基因。从mRAN水平来寻找靶基因主要是通来在细胞内过表达miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。这种方法由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变, 因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题。 故采用蛋白质质谱的方法可以有效弥补这个不足。同时再结合miRNA靶基因的预测方法，可以大大提高了靶基因的检出率及可靠性。

目前鉴定靶基因最直接的方法是, 利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系。 这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点。 而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法。 其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体, 将希望鉴定的miRNA靶基因的3´UTR构建到荧光素酶基因的3´UTR中, 然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平, 最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3´UTR中是否含有miRNA的靶位点。返回搜狐，查看更多