征雄
多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女常见的内分泌疾病，也是导致女性不孕的主要因素。PCOS的主要病理生理学问题是高雄激素血症。高雄激素血症可以通过生化试验或临床表现来评估。目前大多数临床实验室基于免疫学的雄激素常规检测方法存在诸多缺陷，如交叉反应、检测低浓度样本准确性差、不同品牌试剂检测结果缺乏可比性等，导致高雄激素血症评价出现假阳性结果。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、可同时检测多个靶标等优点，是一种更高效的雄激素检测方法。基于临床和实验室循证医学证据，首都医科大学附属北京妇产医院和中国人类健康科学技术促进会联合临床检验、妇科内分泌、质谱应用等领域的学者共同制定了《专家共识》，旨在为医疗机构开展PCOS雄激素检测提供建议和指导。专家共识声明包括对PCOS雄激素的实验室检测项目和方法的建议，以及使用LC-MS/MS检测雄激素面临的挑战和对策。
关键字
多囊卵巢综合征；高雄激素血症；液相色谱串联质谱
1多囊卵巢综合征概述
多囊卵巢综合征(PCOS)，即Stein-Leventhal综合征，由Stein和Leventhal于1935年首次报道。它是一种由遗传和环境因素共同引起的常见内分泌代谢疾病。其主要临床表现为月经不调、不孕、高雄激素血症、多囊卵巢，可伴有肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等代谢异常，并可能导致其发生。PCOS的流行率因诊断标准、种族、地区和人口而异。高发年龄为20-35岁，育龄妇女PCOS患病率为5%-10%。
目前，PCOS病理生理学的核心问题是高雄激素血症，这已成为该领域专家的共识。高雄激素血症是指女性体内雄激素水平升高或功能亢进。一般通过临床表现或生化检查来评估雄激素的升高。高雄激素血症的临床表现主要是多毛、痤疮、脱发和男性体征；生化指标主要是总睾酮(TT)、游离睾酮(FT)、脱氢表雄酮(DHEA)、脱氢表雄酮硫酸酯(DHEA-S)和4-雄烯二酮(A4)。2018年发布的《中国多囊卵巢综合征诊疗指南》(简称《中国PCOS诊疗指南》)建议，育龄期、围绝经期和青春期女性应首先进行高雄激素血症评估，逐一排除其他可能引起高雄激素血症和排卵障碍的疾病，以明确诊断PCOS。
2雄激素检测和高雄激素血症评估
雄激素是一种含19个碳的甾体激素，主要包括TT、A4、DHEA-S、DHEA和双氢睾酮(DHT)。育龄期女性的雄激素由卵巢和肾上腺产生，而绝经后女性的雄激素主要来自肾上腺。生理上，卵巢和肾上腺各产生25%的睾酮，另外50%由外周组织中的A4转化而来。A4来自卵巢和肾上腺，各产生50% A4。女性血液循环中80%的TT与六雄激素结合球蛋白(SHBG)结合，19%与白蛋白结合，只有约1%以FT的形式存在，起到雄激素的生理作用。A4、DHEA和DHEA-S以非约束状态存在于女性体内。
3PCOS患者不同雄激素检测的临床意义
3.1TT目前，血清TT水平的测定是临床评价女性雄激素升高的主要方法。总的来说，抗米勒激素和TT联合检测对PCOS具有较高的诊断价值。如果患者在短时间内出现男性特征，TT水平高于参考区上限2.0 ~ 2.5倍[5.21 ~ 6.94 nmol/L(150 ~ 200 ng/DL)]，则需要进行超声、磁共振成像等影像学检查，帮助鉴别诊断卵巢或肾上腺分泌雄激素肿瘤。
3.2英尺女性血清中约99%的TT会与SHBG和白蛋白结合，只有约1%的TT以游离形式存在。生物活性睾酮包括非特异性结合白蛋白的TT和睾酮。一些研究结果表明，血清FT水平升高是诊断高雄激素血症的最佳指标。目前报道的FT直接测定方法都是基于质谱，其中LC-MS/MS是测定FT的首选方法，但该方法在临床应用中有很多局限性，如耗时长、非特异性结合、体积迁移效应等，不适合常规实验室开展。常用的替代方法是根据SHBG和TT计算游离睾酮指数(FAI ),与平衡透析测得的FT有很好的相关性和一致性。
血液循环中的TT与SHBG结合紧密，超重PCOS患者的SHBG水平通常较低，这是生物活性睾酮水平升高的主要原因。同时，低SHBG还可以使循环睾酮降低到正常水平，从而掩盖雄激素过剩的状态。在这种情况下，我们可以考虑检测SHBG，计算FAI来确定是否存在高雄激素血症。KEEVIL等人的研究结果表明，SHBG也会与其他性激素结合，一些雄激素也会与白蛋白结合，白蛋白会与许多物质偶联，水平波动很大。因此，当SHBG水平过低时，很难准确估计FAI，不能反映患者体内雄激素的真实活性，需要根据相关临床表现来判断高雄激素血症。
3.3A4作为TT的前体，A4对判断PCOS患者的雄激素水平具有重要意义。研究发现，同时测定血清TT和A4是预测PCOS患者代谢风险的有效方法。用LC-MS/MS测定A4和TT，然后计算FAI，可以提高高雄激素血症的筛查效率。高雄激素血症的PCOS患者更容易出现性激素异常、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和脂代谢紊乱，尤其是A4增高的PCOS患者。但目前大多数医疗机构的临床实验室都没有开展该项目，这一共识建议临床应重视血清A4的检测。
3.4脱氢表雄酮-S/脱氢表雄酮-S是DHEA的硫酸盐形式，是DHEA和其他雄激素的“储存体”。它的半衰期比DHEA长，是肾上腺雄激素的主要标志。2015年，美国临床内分泌学家协会(AACE)、AmericanCollegeofEndocrinology、ACE)、雄激素释放和卵巢学会(AES)联合发布了PCOS的诊疗指南。指出30% ~ 35%的PCOS患者有DHEA-S升高，约5%的PCOS患者只有DHEA-S升高..GOODARZI等人的研究结果表明，20% ~ 30%的PCOS患者伴有DHEA和DHEA-S水平升高。
值得注意的是，当DHEA-S水平超过8mg/L(800μg/dL)时，提示可能有肾上腺肿瘤。基于LC-MS/MS方法的TT和DHEA-S水平联合体重指数(身体质量指数)对PCOS具有较高的诊断效率和较大的临床应用价值。因此，在实验室进行多种雄激素的联合检测可以提高PCOS诊断的准确性，从而避免漏诊。
3.5DHTDHT由TT经5α-还原酶转化而来，其雄激素活性远高于TT。DHT也是导致雄激素过多症临床症状(痤疮、多毛症和脱发)的主要雄激素。在DHT的刺激下，皮脂腺分泌过多，会导致游离脂肪酸增加，亚油酸减少，从而促进痤疮丙酸杆菌的生长繁殖，进而形成痤疮。DHT主要存在于细胞和毛囊根部，很少进入血液循环，在血清中含量也很少，用常规免疫学方法无法准确定量。发现LC-MS/MS可以同时检测PCOS患者的TT、A4、DHEA-S和DHT，可以将高雄激素血症的检出率从67.6%提高到91.0%。
根据上述临床和实验室证据，在评估疑似PCOS患者的高雄激素血症时，我们对雄激素检测的类型提出以下建议:
建议1:由于PCOS患者高雄激素血症的比例较高，涉及的主要雄激素有TT、A4、DHEA/DHEA-S和DHT，大多数PCOS患者伴有两种或两种以上雄激素水平升高，建议准确测定TT、A4、DHEA/DHEA-S和DHT。
建议2:建议在有资质的实验室使用平衡透析-质谱直接测定FT。如果条件有限，建议先用质谱测定TT，再用SHBG计算FAI，与平衡透析-质谱测定FT的结果有较好的一致性和相关性。
建议3:建议同时检测多种雄激素(TT、A4、DHEA/DHEA-S、DHT)的水平，以准确判断雄激素的来源，为后续的诊断和治疗提供更全面的评估信息。
建议4:如果由于实验室条件无法同时检测TT、A4、DHEA/DHEA-S和DHT水平，建议先确定TT和DHEA-S，评估雄激素异常来源(肾上腺或卵巢)，结合SHBG计算FAI。
4.雄激素的检测方法
准确可靠的分析方法是准确评价高雄激素血症的关键。目前，临床实验室普遍使用化学发光免疫分析法(CLIA)。该方法发光分析灵敏度高，免疫反应特异性强，操作简单，自动化程度高。但现有的以免疫学为基础的检测方法仍存在诸多缺陷，如交叉反应、检测低浓度样本准确性差、不同品牌试剂检测结果缺乏可比性等，导致高雄激素血症诊断准确性下降(如假阳性结果)。与免疫学方法相比，LC-MS/MS具有更高的检测灵敏度和特异性，更宽的线性范围和同时检测多个靶标的优点，因此是一种更有效的雄激素定量方法。近年来，质谱设备和样品前处理方法不断改进和更新，特别是稳定同位素内标的加入，LC-MS/MS检测越来越适合临床实验室的常规发展。值得注意的是，国外主流内分泌学学术期刊已逐渐要求必须通过质谱测定女性雄激素水平，以确保结果更加可靠，为研究结论提供更加确凿的证据。2018年，PCOS国际循证医学指南再次强调使用LC-MS/MS确定TT和FT的必要性。基于方法学优势，LC-MS/MS可有效克服免疫学方法灵敏度和特异性相对较低、线性范围窄、无法同时检测多项指标等缺点，有助于在临床上更高效地鉴别和诊断高雄激素血症。目前，基于免疫学的雄激素检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、CLIA和放射免疫分析法(RIA)。TT、DHEA/DHEA-S、DHT和A4的比较见表1。
从表1可以看出，免疫学方法无法解决低水平雄激素检测中交叉反应引起的干扰问题，如甾体激素结构类似物和异构体与抗体结合，会降低抗体与雄激素的结合特异性，从而导致假阳性结果。虽然结合萃取和层析纯化的RIA具有良好的检测灵敏度和可接受的特异性，但由于需要使用放射性同位素，目前还不能商业化。
根据上述临床和实验室证据，在评估疑似PCOS患者的高雄激素血症时，我们对雄激素的检测方法提出以下建议:
推荐1: LC-MS/MS是测定小分子激素的金标准，灵敏度和特异性高，可同时检测多种雄激素。建议LC-MS/MS应作为雄激素过多症评估中雄激素测定的首选方法。
建议二:免疫学方法检测低浓度样本灵敏度和特异性较低，不建议作为高雄激素血症评估的首选。
建议三:考虑到免疫学方法的固有缺陷，如交叉反应，如果实验室因条件限制无法开展质谱检测，建议结合患者临床表现对结果进行适当解读。
5LC-MS/MS测定女性雄激素面临的挑战及对策
尽管已有大量证据表明LC-MS/MS可以降低PCOS诊断的假阳性率和假阴性率，但该方法在临床应用中仍面临诸多挑战。
1)临床实验室人员的质谱技术培训专业性强，周期长。临床质谱检测是一项涵盖分析化学、精密仪器、临床检验等学科的检验技术，对实验人员的理论知识水平、设备操作能力和结果分析能力要求较高。
2)市售试剂盒选择有限，样品前处理方法复杂。质谱检测女性雄激素还是一种新方法。目前，获得体外诊断试剂注册证书的商品化试剂盒数量有限，不同品牌的试剂盒在雄激素检测类型、样品预处理流程、检测灵敏度和特异性等关键指标上存在较大差异。此外，由于女性体内雄激素含量相对较低，通常需要进行固相萃取、衍生化等复杂的样品前处理。这些预处理方法多为手工操作，步骤复杂，容易出错。
3)有必要建立一个适当的参考区间用于3)PCOS患者雄激素的质谱检测。虽然我国PCOS诊疗指南提供了雄激素升高的判断标准，但现有的参考区间大多是基于免疫学方法建立的，不能直接应用于质谱检测。但在实际操作中，LC-MS/MS测定的女性雄激素水平普遍低于免疫学方法，因此需要建立以健康女性为基础的雄激素测定参考区间。
鉴于上述LC-MS/MS在检测女性雄激素方面面临的挑战，我们提出以下建议:
建议1:临床实验室的MS技术人员需要经过严格的理论和操作培训，考试合格后才能上岗。培训和考核内容包括但不限于色谱-质谱原理、仪器使用、日常维护和数据分析。质谱技术人员应能在与临床沟通的前提下，正确解读异常报告。
建议二:选择商品化试剂盒时，应重点关注以下指标:覆盖的雄激素种类是否齐全，样品前处理方法是否简单可靠、自动化程度高，检测灵敏度和特异性是否满足PCOS临床诊断要求。如果实验室是自建的，临床应用前应根据《医疗器械监督管理条例》和CLSI C62-A的相关规定和指南进行严格的方法学评价
建议3:在解释女性雄激素测定结果时，应采用基于LC-MS/MS的参考区间。如果采用试剂生产商提供的文献报告或参考区间，应根据CLSIEP28-A3c等相关指南进行验证。
6摘要
PCOS患者的雄激素水平存在很大的个体差异。LC-MS/MS具有灵敏度高、特异性强、多靶点检测等优点，可有效评价高雄激素血症，为临床诊断提供更准确的实验室依据。虽然受到一些客观因素的限制，它在临床可及性方面仍面临诸多困难，目前大部分基层医疗机构无法开展常规检测，但其检测效率是值得肯定的。相信在多方的共同努力下，将会有越来越多的临床实验室使用LC-MS/MS准确测定PCOS患者的雄激素水平，从而更好地为临床诊疗提供参考，造福广大女性患者，为新时代中国生育政策的有效推广提供助力。
作者:曹政(首都医科大学附属北京妇产医院临床质谱检测中心)、阮(首都医科大学附属北京妇产医院妇科内分泌科)、翟(首都医科大学附属北京妇产医院临床质谱检测中心)、黄(上海百曲代谢组学技术研究中心)、谢(上海交通大学医学院)
专家组成员(按字母顺序):曹政(首都医科大学附属北京妇产医院)、陈亚军(南京市妇幼保健院)、郭伟(复旦大学附属中山医院)、胡(重庆医科大学第一附属医院)、胡(广州市妇女儿童医疗中心)、黄(安国际医学中心医院)、黄(上海百曲代谢组学技术研究中心)、李蓉(北京大学第三医院)、李水军(上海市徐汇区中心医院)、 (河北医科大学第一医院)、(中国科学院生物物理研究所)、李(首都医科大学附属北京妇产医院)、(中国医学科学院北京协和医院)、阮(首都医科大学附属北京妇产医院)、史(杭州妇产医院)、(首都医科大学附属北京儿童医院)、孙智(郑州大学第一附属医院)、孙鹏明(福建省妇幼保健院)、 万志辉(首都医科大学附属妇产医院)、(青岛大学附属医院)、王悦(河南省人民医院)、谢(上海交通大学医学院)、(宁夏医科大学总医院)、徐红。 杨(中山大学孙逸仙纪念医院)、杨梅(贵州省妇幼保健院)、杨欣(北京大学人民医院)、叶喜阳(深圳市人民医院)、于(海军军医大学第一附属医院)、张月香(天津市中心妇产科医院)、(南方医科大学南方医院)、朱天元(甘肃省中心医院/甘肃省妇幼保健院)
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